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基因治疗的方法


来源:39康复网      作者:39康复网      点击:次      时间:2008-02-24

 

第二节 基因治疗的方法

  1.基因转移方法

  (1)特异正常基因的分离与克隆:应用重组DNA和分子克隆技术结合基因定位研究成果,已有不少基因并将会有临床上应用也受限制难以进行。今后如能改进技术,提高重组率,这种定点修正基因的方法仍是有前景的。

  4)病毒介导基因转移:前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。病毒介导基因转移(viral mediated gene transfer)是通过转换方式完成基因转移,即以病毒为载体(vector),将外源目的基因通过基因重组技术,将其组装于病毒上,让这种重组病毒去感染受体宿主细胞,这种病毒称为病毒运载体(viral vector)。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。

  ①反转录病毒载体:反转录病毒虽是RNA病毒,但有反转录酶,可使RNA转录为DNA,再整合到宿主细胞基因组。反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力,可使近100%的受体细胞被感染,转化细胞效率高;其次,它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性;再者随机整俣的病毒可长期存留,一般无害于细胞,但也存在缺点:这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体,而不适合于那些不能正常分裂的细胞,如神经元。最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因,就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。因此,人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去,仅留它们的外壳蛋白,以保留其穿透细胞的功能,试图避免上述缺点。这种改造后的病毒称为缺陷型病毒(defective virus)。这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA,有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组,而该病毒则死亡。由于病毒整合基因组是随机的,所以还是可能激活细胞的原癌基因,以及因随机插入发生插入突变。

  在反转录病毒载体中,最常用于人类的是莫洛尼(Mooney)鼠白血病病毒(murine leukemia virus;Mo-MLV),其人工构建的结构如图14-1。

  ②DNA病毒介导载体(DNA viral mekiated vector):DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等,一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒,实用意义不大,但

图14-1 Mo-MLV结构示意图

LTR:长末端重复序列,内含启动子、增强子及有关调节顺序;gag:病毒核心抗原基因;
env:病毒外壳蛋白基因;pol:反转录酶基因

  牛乳头瘤病毒重组后,可不插入宿主染色体中引起插入突变,又可在宿主染色体外独立复制,并表达出基因产物。有人发现,因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒,可在表达E1基因的细胞中繁殖。后来证明,载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。它代表了基因治疗的新方向。图14-2是人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中,感染细胞经培养后再输入病人进行治疗的模式图。

图14-2 人的外源基因包装在缺陷型反转录病毒中感染细胞
经培养后再输入病人体内进行治疗模式图

  最近,美国设计了一个新的腺病症载体(图14-3),它是用一个化学连接器即赖氨酸链(lysine chain)将DNA栓在病毒外壳上,这样组成的运输器,通过一个表面抗体而进入细胞核,使宿主基因与治疗基因共同表达。这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体(adeno virus-polylysine DNA-complex)。

图14-3 腺病毒赖氨酸DNA复合体

  采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点:①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞,并能得到大量基因产物,对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义;②病毒颗粒相对稳定,并易于纯化和浓缩,且感染力不降低;③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外,并持续表达;④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群,无致癌性。前述的新腺病毒载体还有一大优点是可以成功地运载48000bp的基因,而其它病毒只能运输70 00bp的基因。这些优点显示了腺病毒介导载体的广阔应用前景。

  2.靶细胞:这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是:①必须较坚固,足以耐受处理,并易于由人体分离又便于输回体内;②具有增殖优势,生命周期长,能存活几月至几年,最后可延续至病人的整个生命期;③易于受外源遗传物质的转化;④在选用反转录病毒载体时,目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用得较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等。许多遗传病与造血细胞有关,故可用于如β地贫、严重复合免疫缺陷病等的基因治疗。皮肤成纤维细胞易于移植和从体内分离,又可在培养中生长,并易存活,故有人用之于乙型血友病的基因治疗。有不少遗传病表现了肝细胞功能缺陷,因此,在家族性高胆固醇血症的治疗中,有将低密度脂蛋白(LDL)受体基因转移至肝细胞的尝试。在动物实验中已证明:β-半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌营养不良蛋白(minidystrophin)基因都已证明能在肌细胞中表达。

 

 

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